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Thermoascus内切葡聚糖酶I基因的DNA条和酶学特性。
发布于:2019-06-07 09:04 点击量:   打印本页 || 关闭窗口
河北农业大学
白球
纤维素是地球上分布最广的可再生资源。
纤维素的使用和转化对于解决世界面临的粮食短缺,环境污染和能源危机问题非常重要。
纤维素酶可以将纤维素水解成葡萄糖。这是一种干净,有效的纤维素用途。
然而,纤维素酶的成本仍然很高,并且一些纤维素酶具有活性低或热稳定性低的缺点。通过定向进化,可以不断改进重组纤维素酶的新性能。
在该实验中,例如,研究了嗜热内切葡聚糖酶基因,例如,通过DNA结合技术突变野生型,以通过重组获得具有高内切葡聚糖酶活性的突变体。稳定性高
本研究的主要结果如下:
1
通过优化关键因子,例如用DNase消化的时间,不含引物的PCR和引物的PCR模板的量,建立了适合于内切葡聚糖酶thermoaspus基因破坏的条件。
2
例如,使用质粒pMD-18T-egl作为PCR扩增的模板以获得I型。使用DNA改组技术获得大约400个突变体克隆,并选择20个随机菌株用于测序和序列分析。突变率为零。
11%?0
43%
3
将含有突变基因和酵母表达质粒pPIC9K的重组pMD-18T-egI质粒用SnaBI和NotI消化,与T4 DNA连接酶连接,转化到大肠杆菌DH5α中,并提取以提取质粒。具有不同片段的质粒
线性化后,使用LiCl转化方法将它们转移到毕赤酵母GS115感受态细胞中,并在MD平板上选择Mut - + His - +转化体。
诱导阳性转化体在基础盐培养基中表达,通过酶活性测定选择活性较高的BY2菌株,酶活性为23。
75 U / mL,几乎比初始菌株的酶活性高10倍。
4
为了获得高表达转基因菌株,从突变体中提取基因组,并使用EG-S和EG-A作为引物扩增突变基因,并且发现它是第十三突变体。突变基因
将突变的基因连接到pPIC9K中并线性化以进行电穿孔。
通过选择活性,获得了高活性突变体BY213,在碱性盐培养基中培养168小时后酶活力达到78。
63 U / ml,蛋白质含量达到1。
14毫克/毫升。
通过SDS-PAGE分析表达产物,分子量为34。
1 KDa

研究了菌株BY213的内切葡聚糖酶的酶学性质。最佳反应温度为65℃,最适pH为3。
5,pH 2。
5到4
它仍然显示出90%或更高的酶活性。即使在55℃温育30分钟后,酶活性仍保持在85%以上但pH为2。
5?8
5的稳定性低,仅保留了原始酶活性的40%至65%。